一文搞定！RT-qPCR流程设计

PCR（polymerase chain reaction，聚合酶链反应）是一种常用的分子生物学技术，用于扩增DNA片段。它利用DNA聚合酶在模板DNA上的反复扩增（涉及到三个步骤：变性、退火和延伸）来实现短时间内产生大量特定的DNA序列。PCR技术已经被广泛用于基因检测、病毒检测、DNA测序等领域。

在变性步骤中，模板DNA被加热以使其变性，即将其双链DNA分离成两条单链DNA。在退火步骤中，引物与模板DNA结合形成一个双链DNA结构。在延伸步骤中，聚合酶沿着模板DNA链合成新的单链DNA，从而扩增特定的DNA片段。

为检测RNA的数量和表达水平，常联合使用反转录和实时荧光定量PCR的技术，全称为实时定量逆转录聚合酶链式反应（Real-Time Quantitative Reverse Transcription PCR)。这是NCBI官网上对其的称谓，简写为Real-Time qRT-PCR。显然其强调的是对于Reverse transcription PCR之后的Real-Time Quantitative，是从内到外的一种强调形式。它利用反转录酶将RNA转录为cDNA，再通过实时荧光定量PCR技术定量测量cDNA的数量，从而确定RNA的表达水平。这也是生物医学上用的最常规的实验方法。

而在MERK官网上对于RT-qPCR的描述为：RT-qPCR, or quantitative reverse transcription PCR, combines the effects of reverse transcription and quantitative PCR or real-time PCR to amplify and detect specific targets. .... Quantitative reverse transcription PCR (RT-qPCR) involves the detection and quantification of RNA。可以看出，他们将quantitative PCR和real-time PCR统一表示为qPCR，前面的RT为reverse transcription。

而我们常用的Bio-Rad仪器的公司官网，则对其表述为：Reverse Transcription Quantitative PCR (RT-qPCR)，这可能更符合实验顺序，先逆转录、后做qPCR。但通过上面对MERK官网学习的理解，不难发现，quantitative PCR和real-time PCR基本是等价的。

此外，在2020年6月份，《Biochemist》特别发表过一篇文章《A beginner’s guide to RT-PCR, qPCR and RT-qPCR》，里面指出：According to MIQE, the acronym ‘qPCR’ describes quantitative real-time PCR, which is the PCR amplification of DNA in real time, measured by a fluorescent probe, most commonly an intercalating dye or a hydrolysis-based probe, enabling quantitation of the PCR product. This technique is used to detect the presence of pathogens and to determine the copy number of DNA sequences of interest. The final acronym ‘RT-qPCR’ is used for reverse transcription quantitative real-time PCR. This is a technique which combines RT-PCR with qPCR to enable the measurement of RNA levels through the use of cDNA in a qPCR reaction, thus allowing rapid detection of gene expression changes。

所以逆转录实时定量PCR全称的简写多以RT-qPCR见著。但有时Real-Time qRT-PCR或是单纯只写qRT-PCR默认地与RT-qPCR等同，而见诸纸端。总的来说：Real-Time quantitative reverse transcriptionPCR == Real-Time qRT-PCR == reverse transcription quantitative real-time PCR == Reverse transcription qPCR == RT-qPCR ≈≈ qRT-PCR。值得注意的是，在反转录完成后进行实时荧光定量PCR的步骤，一般统称为qPCR。这里个人推荐使用Reverse Transcription Quantitative PCR (RT-qPCR) 在文章中进行相应表述。图 2.1 qPCR反应体系设置

预变性是将样本和反应缓冲液混合在一起，在高温下（通常为95℃）孵育一段时间，以使DNA或RNA解离。这样做可以防止样本中的DNA或RNA在PCR反应中不完全解离，从而影响PCR反应的准确性。

根据热启动酶的不同而有所区别，具体可参考试剂商提供的手册，但一般95℃ 10min足够适用。

循环反应是PCR反应的核心步骤，其目的是扩增DNA或RNA模板的特定区域。

PCR反应一般分为三个步骤：变性、退火和延伸。

1）变性，是将DNA或RNA模板解离成单链，通常在95℃下进行；具体可参考试剂商提供的手册，95℃ 15s一般适用。

2-3）退火，是引物与DNA或RNA模板结合的过程，通常在55-65℃下进行（一般来说，引物的加入是过量的，引物的设计可参考文章：超全！PCR跨内含子引物设计：从理论到实践）；延伸，是在酶的作用下，以dNTP为底物将引物扩增的DNA或RNA模板合成双链，通常在72℃下进行。通常来说，退火+延伸：60℃ 1min一般适用（延伸时间通常设置为1分钟/kb）。 具体可参考试剂商提供的手册。一般情况下，60℃是一个比较适合的延伸温度，而不是72℃，原因如下：a）特异性：Taq DNA聚合酶酶活的温度范围比较广，但是高温下（如72℃）容易发生非特异性的DNA结合和附着。在60℃的温度下，Taq DNA聚合酶酶活的特异性更高，可以更精确地将新的核苷酸添加到目标序列的末端。2）PCR产物长度：延伸温度会影响PCR反应的产物长度。在高温下（如72℃），延伸反应速度较快，可能会导致DNA链的错误连接和错误延伸，从而生成不必要的PCR产物。而在60℃下，延伸速度较慢，有助于生成比较精确的PCR产物。3）PCR反应效率：在72℃下，Taq DNA聚合酶酶活的效率更高，因此理论上PCR反应效率更高。但是，在实际应用中，由于高温下的非特异性扩增和错误连接，可能会导致PCR产物的杂交和竞争，影响PCR反应的效率和特异性。

4）循环反应需要进行多次（通常是30-40次），以扩增足够的DNA或RNA产物。通常来说，循环反应40次（1+39）普遍适用。具体可参考试剂商提供的手册。

熔解曲线（Melting Curve），是用于检测PCR产物的特异性的一种方法。通常在PCR反应结束后，将温度从60℃升高到95℃，并记录PCR产物的荧光值，以绘制溶解曲线。根据PCR产物的特异性，可以得出产物的Tm值和是否存在非特异性产物的信息。

SYBR Green染料没有序列特异性，对DNA模板没有选择性，可以结合到包括非特异产物和引物二聚体在内的任何dsDNA上，因此有必要区分目标信号和假信号。在整个PCR完成后进行，控制体系温度缓慢升高（60-95℃），双链DNA解链为单链，SYBR Green被释放，荧光信号逐渐减弱。将温度从60℃升值95℃，每升高1℃仪器会自动收集荧光信号，得到的荧光信号是逐渐下降的过程，且在Tm值下降最快。为方便分析，将温度与荧光强度的变化求导，即得到单峰的熔解曲线，就可以证明引物特异性良好，实验结果不受非特异性扩增和引物二聚体的干扰。Tm，是指PCR产物双链DNA中一半链断开的温度，即PCR产物的熔解温度。Tm值取决于PCR产物的长度和碱基组成，因此不同长度和组成的PCR产物具有不同的Tm值。

普遍适用的熔解曲线设置：95℃，5Sec，65℃ 5Sec，95℃ 0.5℃。熔解曲线采集程序不尽相同，使用仪器默认即可。第一个95℃，5Sec是为了终止之前的延伸反应；65℃ 5Sec是指将体系温度维持到65℃开始；95℃ 0.5℃是指每单位时间升高0.5℃直到95℃。

一般情况下，抓住下面三点并结合原理即可判断其他异常情况：

1）CT值：在计算之前，检查CT值的可信度，一般CT值应该在25±10（15-35）之间，最多放大到25±15（10-40），但一般来说通常将CT值在25到30之间作为检测结果的临界值。

2）扩增曲线：一般呈.S型‘，如果扩增曲线呈.指数型‘（图 2.2，来源：QPCR-如何判断引物设计是否有问题）增长，则说明cDNA浓度过低。图 2.2 扩增曲线问题

3）熔解曲线多峰：在理想情况下，只有特定长度和组成的PCR产物才会产生单个明显的熔解峰。如果PCR反应存在非特异性扩增或污染，则可能会导致多个熔解峰或模糊的熔解峰（图2.3，来源：QPCR-如何判断引物设计是否有问题），此时通常要重新设计引物。图 2.3 熔解曲线多峰

4）Tm值：一般正常qPCR产物，大小在100-300bp之间，熔解曲线Tm大多在80℃以上，若Tm<80℃，有可能出现引物二聚体。

如若反复排除仍无法找到原因，建议将qPCR的产物作一次琼脂糖凝胶电泳，看是否在相应扩增条带上有显影（图 2.4，来源：QPCR-如何判断引物设计是否有问题）。图 2.4 琼脂糖凝胶电泳验证产物

一般来说，跑qPCR的时候，每一个组要有三个生物学重复，每个重复需要有三个复孔（如图 3.1）。图 3.1

Ctr组里面有1、2、3个重复，称为生物学重复。在qPCR实验中，三个生物学重复的CT值的差异大小应该小于等于0.5才能被认为是具有良好的重复性。——生物学重复（即使用多个相同来源的样本）

Ctr1组里面重复取了3个样，而得到了CT1，CT2和CT3三个值，称为技术重复。三个技术重复的CT值的差异大小一般要小于等于0.3才能被认为是良好的重复性。——技术重复（即在同一样本上进行多次qPCR）

首先计算技术重复的平均值，一般采用算术平均数， ，如若重复性不好，可考虑增加样本量。在合适的情况下，技术重复的重复性不是很好时（如差值介于0.3~0.5），可考虑对技术重复采用几何平均数， 。

获得各技术重复的均值后，简化表格，计算ΔCT（图 3.2）： 。图 3.2

图 3.3

图 3.4

注意average是同一个，如果使用Excel运算，请在函数上加$。

方法的基本思想是，将ΔΔCT转换为相对表达量的指数形式，即2的负ΔΔCT次方。这是因为，在qPCR实验中，每个CT值的增加相当于RNA模板数量的二倍下降，因此，ΔΔCT值的二倍对应于相对表达量的二次方。另外，在qPCR实验中，CT值是衡量PCR反应产物的相对丰度的指标，也称为荧光阈值。CT值是PCR扩增过程中荧光信号强度超过一个预设阈值的循环数。通常情况下，CT值越小，说明PCR反应产物在更少的循环数内就达到了阈值，即PCR扩增效率更高，反应产物更丰富。因此ΔΔCT一般取负值，即2的负ΔΔCT次方，即 。图 3.5

图5中 这一列即可用于统计计算，基因相对量一列史各组的的均值，可用于初步判断。同时也可在Excel表格对于Ctr组和Treat组各自3个生物学重复，可以使用t.test（但是注意不同的比较方式要用各自适用的统计学方法）进行进一步的统计学意义判断。

此时，有朋友可能会问，如果我各组的生物学重复大于3个怎么办？因为有时一块板子上无法完成所有组别的点板加样，那么有一种方法是同时将原始的CT值在一个组内同时列出再进行后续的计算即可。

但有时在多次实验中，某一次实验内的生物学重复很好（CT差值小于0.5），但在各次之间的CT值相差很大，这种情况下，可以对每一次进行单独的运算，最后把这一列单独弄出来作合并，根据组别进行统计，因为此时对参考组都进行了归一化处理。

在理解了上述问题后，其实有一种更稳妥的方式，那就是，平时Ctr组里面的目的基因的CT值和内参基因的CT值相减时（即求ΔCT时），他们其实并不是一一对应的。我们只是人为的排了序。

那么为了消除这个影响，我们很多时候在计算ΔCT值的时候会用各组重复中目的基因的CT值减去各组内参的均值（图 3.6），其他后续计算不变。图 3.6

但对于多块板重复进行同一次实验，或是想把多块板的数据合并（内参相同），可能需要有以下几种考量：

1）板间校正（inter-run calibration）(图 3.7-3.9）—— 最标准的方法：若实验中涉及需要多块孔板数据合并的情况，则建议使用 maximum samples per target 策略来布板，并设置板间均一化因子（Inter run calibrator）。这对于正确进行含多次运行的 qPCR 实验数据分析是必须的。图 3.7 Bio-Rad CFX Maestro用户手册提及的Inter-run calibration图 3.8 VIB对于qBase+软件使用inter-run calibration的推荐图 3.9 一篇文章中对于板间校正的设置（文章标题：Assessment of common housekeeping genes as reference for gene expression studies using RT-qPCR in mouse choroid plexus）

2）简化版方式：根据板间校正的原理，主要控制的是各板之间的内参基因，因此：如果使用的qPCR体系完全一致（包括样本、酶、qPCR板子/膜、仪器等），重复实验相隔时间很近，内参基因在两次实验之间CT值相差很小（0.5以内），整体重复量并不是特别大（如96×3<384）则可能可以考虑，在各板各自计算相对表达量之后，将 这一列单独弄出来作合并计算。但使用时要十分谨慎。

3）R语言：可以使用R包对各次之间进行去批次化处理。

具体的板间校正（inter-run calibration，IRC）后续在进阶版中将会进一步介绍。

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